领航基因PCR前沿技术发展及应用专题研讨会精彩
发表时间:2019-06-13

  为促进全国PCR技术研发及应用人员进行技术交流,近日领航基因参加了由仪器信息网举办的第三届“PCR技术前沿及应用”专题网络研讨会,并邀请厦门大学杨朝勇教授做专题报告,介绍数字PCR技术应用领域最新进展。

  数字PCR技术是近年来广受关注的全新一代分子诊断技术,在本次研讨会上也是各路学者大咖交流的热点。杨教授以多重荧光数字PCR技术为切入点,为在线观众献上了一场精彩的报告。由于时间关系,很多人可能没有机会现场收看这次讲课,现将杨教授报告中部分内容整理后与大家分享,共同学习。

  1983年美国科学家 Kary mullis提出聚合酶链式反应构想,开启了“第一代”PCR技术的先河。但通过琼脂糖电泳对扩增结果进行分析,存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等缺点。90年代“第二代”荧光定量qPCR问世,在PCR扩增的同时对反应体系中的荧光信号进行实时收集,通过Ct值和标准曲线来分析结果,PCR技术实现了商业化发展。但依赖于Ct值只能获得相对定量的结果,而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下,其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下,“第三代PCR”-数字PCR技术应运而生,由于其独特的技术优势和应用前景,2006年后数字PCR技术产业化发展相当迅速。

  20世纪末,Vogelstein等提出数字PCR(digital PCR,dPCR) 的概念,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号通过泊松分布进行统计学分析。这一巧妙的设计使得靶分子的荧光信号可以在数万个反应单元中一个一个直接“数出来”,实现了绝对定量。

  当一份样本分散成20000个反应单元时,其靶基因丰度提升了330倍,相应的背景核酸与各种干扰物质的影响大大降低。这也是dPCR在检测灵敏度和稳定性上大幅超越qPCR的关键原因。

  多种荧光修饰的探针及其引物组成不同的扩增体系,当数字PCR扩增体系中存在多个目标

  随着数字PCR技术的发展,目前核心技术已从高效稳定的液滴生成向多重荧光通道迈进,未来将走向全自动一体化。与国际主流产品相比,我国自主知识产权数字PCR系统已经在多重荧光通道检测技术上取得领先,其中领航基因公司2018年获得3通道荧光阅读仪批文后,2019年其5通道荧光阅读仪iScanner5获得药监局二类医疗器械注册证,代表了当前多重荧光数字PCR技术的最高水平。后续开发方向有荧光通道的进一步扩展,以提升数字PCR的多重检测效率,可以帮助临床用户从一份样本中获得更多的信息。在系统的自动化与集成化上,领航基因正在开发的全自动一体化数字PCR工作站,通过简单几步操作即可完成从核酸提取到数据分析的整个检测流程,极大简化人工操作步骤。

  领航基因多重荧光数字PCR系统由仪器平台与配套芯片组成,整个检测过程约两个半小时,包含核酸纯化、芯片上样、PCR扩增、荧光扫描、数据分析几个步骤。其中样本液滴生成基于自主专利的油相配方和独特的微流道设计,在封闭芯片内部快速生成均匀、稳定的单层平铺液滴,确保样本加载芯片后不再需要移液操作,最大程度避免人为操作带来的交叉污染和样本损耗。5色荧光由FAM/VIC/ROX/Cy5/Cy7组成,可同时对32个样本进行5通道检测。

  数字PCR技术具有超高灵敏度、精准定量的优势,使之尤其适合极微量核酸分子的定量检测以及复杂样本中的稀有突变检测,在肿瘤、生殖健康以及微生物感染检测方面具有非常好的临床应用前景。多重荧光数字PCR,可以满足临床常见的多项指标联合检测需求,已成为近期的研究热点。

  随着数字PCR(digital PCR, dPCR)、二代测序(next generation sequencing, NGS)等方法的出现,定量检测EGFR突变已经成为可能。多项临床试验证明,患者服用靶向药物过程中,可选择进行多次的动态监测血液中与药效相关驱动基因的突变丰度,以提示药物疗效评估患者病情进展,在此领域的应用中,高灵敏度、可实现定量检测的数字PCR技术具有极大优势。而多重荧光技术可以对EGFR突变进行多位点联合检测,香港挂牌挂牌宝典汇总!向临床提供全面信息。

  EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区,由28个外显子组成。其突变主要发生在EGFR酪氨酸激酶的ATP结合位点的编码区(第18-20外显子)。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药物反应相关,主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸的大约20种缺失约占所有突变的45%,外显子21上L858R的点突变占所有突变的45%左右,外显子18的3种点突变(G719X)约占5%,外显子20的突变占1%左右。另外研究发现,外显子20上的T790M突变与酪氨酸激酶抑制剂药物的耐药性相关。

  领航基因公司多色多重数字PCR试剂盒,可高通量联合检测EGFR基因18外显子、19外显子、20外显子、21外显子上共22种突变位点,特异性强,灵敏度高。

  黄色信号簇=背景信号,红色信号簇=VIC阳性反应孔数,绿色信号簇=ROX阳性反应孔数,蓝色信号簇=FAM阳性反应孔数,浅蓝色信号簇=CY5阳性反应孔数,浅紫色信号簇=CY7阳性孔数(内参)

  通过T790M位点突变的检测限实验结果表明多重数字PCR可检测到突变丰度低至0.1%,显示了极高的灵敏度。

  黄色信号簇=背景信号,蓝色信号簇=FAM阳性反应孔数(790M),浅蓝色信号簇=CY5阳性反应孔数(1#染色体内参)

  胎儿染色体非整倍体异常是导致人类不孕不育、流产、胚胎停育及胎儿缺陷的主要原因,最常见的包括21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征等。

  通过对本例正常男性染色体的多重荧光分析(FAM/VIC/Cy5/Cy7),每组同时检测4条染色体拷贝数,所得定量结果符合预期。

  对领航基因数字PCR系统多重荧光通道精密度的测试显示,在低拷贝下仍然能够维持CV在10%左右,具有较高的精密度和准确性。

  根据中国细菌耐药监测网(CHINET)2018年1-12月的统计数据,在244根据中国细菌耐药监测网(CHINET)2018年1-12月的统计数据,在244,843株临床分离菌中来自呼吸道感染的占39.7%,接着是尿液标本(18.8%),血液标本(14.8%)和其他无菌体液等。

  在97,297株呼吸道分离菌中,占比前八位依次是肺炎克雷伯菌(肺克)、鲍曼不动杆菌(鲍曼)、铜绿假单胞菌(铜绿)、金黄色葡萄球菌(金葡)、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌和大肠埃希菌,这八种菌占呼吸道感染致病菌的80%以上。

  痰液培养是当前呼吸道感染细菌鉴定的主要手段,但存在周期长,标本不合格造成的培养阳性率低等问题。亟需一种方便、准确、快捷的感染细菌鉴别方法,对治疗方案的确定非常关键。

  领航基因的五色荧光数字PCR系统,每张芯片可以同时检测4个目标菌株(需要一个荧光通道做内控/内对照)。只用两张芯片(两个Panels)就可以涵盖呼吸道感染最常见的8种感染菌。

  除了检测目标的8种菌以外,对另外8种常见致病菌的交叉检测表明,两个检测Panel的特异性良好,无非特异交叉扩增信号。下面几张图展示了五色五重体系两个Panel,在目标片段为10copy时的测试结果。所有目标菌的核酸片段均能被正确检出。

  鉴于数字PCR可以直接绝对定量的特性,除了可以用于致病菌的快速鉴定外,还可以用于绝对定量和实时监控,用于评估和及时改进治疗方案。

  综上所述,多重荧光数字PCR技术不仅具有高灵敏度、绝对定量、稳定性好的优势,更进一步满足临床多项指标联合检测需求,提高通量,节约时间,降低成本,具有非常好的应用前景。